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为了进一步除去细胞悬液中个别细胞群，尚可将相应的单抗结合于塑料板上，利用亲和层析的原理作亲和板粘附法，或在细胞悬液中加入单抗和补体，以特异性地破坏相应细胞，使获得的细胞悬液更加均一。 (三)免疫磁珠分离法 近年来免疫磁珠法应用较多，基本方法是将特异性抗体标记在磁性珠上，当细胞与标记了特异性抗体的磁珠混合后，两者发生结合，置于磁铁上，吸取上清中的细胞，即可将所需的细胞分离出来。 (四)荧光激活细胞分离仪分离法 是将荧光标记的抗体与细胞悬液混合后装入样品管内，经荧光染色后通过高速流动系统使细胞排成单行，一个个地流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，经超声系统振荡搅动液流，使液流断裂成一连串均匀小滴，每小滴最多含一个细胞，在激光束照射下产生荧光和散射光，经光电倍增管接收，转换成脉冲信号，经电脑处理分辨细胞类型。借助光电效应，当小滴通过电场时可出现不同偏向，即可收集到所需类型的细胞。该仪器能以5000个细胞/秒的速度高效分离细胞。FACS是集多项功能于一体的细胞分析仪器，除计数细胞外，还可通过荧光染色检测细胞表面标记、细胞增殖周期、区分细胞活性、分选细胞等。 二、免疫细胞的计数 (一)荧光抗体染色 应用范围广泛，可分别使用于B细胞、T细胞及其亚类、MФ及NK细胞的计数及表面标记的测定，多选用间接荧光抗体染色，即活细胞与其特异性单抗作用后再与荧光抗球蛋白抗体反应，经荧光显微镜观察可见膜荧光。 (二)花环形成试验 T细胞与B细胞皆可应用该试验进行计数。计数T细胞的方法称E花环形成试验(erythrocyte rosette formingcell test，ERFC-T)，即取外周血淋巴细胞与绵羊红细胞(SRBC)混合，在一定温度下作用一定时间，使SRBC与T细胞表面的E受体结合，形成以T细胞为中心，绕有SRBC的花环样细胞集团。B细胞计数的方法有EA花环形成试验EAC花环形成试验，前者将红细胞(E)与相应抗体(A)结合成EA悬液，再与受试者的淋巴细胞混合，经制片染色后镜检，计数花环形成率；EAC花环试验仅在EA花环基础上加上补体，使先形成EAC，再与受试淋巴细胞混合。EA和EAC花环试验分别根据B细胞表面存在着FcγR和补体受体。主要应用于淋巴细胞的分离。 三、免疫细胞功能的测定 (一)T细胞功能测定 1.淋巴细胞转化试验(lymphocyte blastogenesis test) T细胞在体外受特异性抗原(旧结核菌素等)或有丝分裂原(pHA、ConA等)刺激后，能转化为淋巴母细胞。试验时取外周血或分离的淋巴细胞，加入有丝分裂原或特异性抗原，在培养液中培养72小时，经涂片染色后镜检计算转化百分率。正常人为70％左右，转化率低表明细胞免疫功能下降。若在培养终止前6小时加入3H-TdR，经β液体闪烁仪检测淋巴细胞内3H-TdR的掺入量，亦可算出转化率。由于活的增殖细胞具有吸收四甲基偶氮唑盐(MTT)的能力，活化的线粒体能裂解四氮唑环而产生颜色反应，并借助酶标仪于波长570nm下测吸光值作为判断指标。MTT法简单易行，常被一般实验室采用。该试验可检测细胞的增殖和细胞毒活性。 |