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（1）连接缓冲液活性低，ATP降解或缓冲液稀释不当
对策：使用一次性分装的缓冲液，避免反复冻融。提供的T4连接酶缓冲液为十倍浓度，正确稀释。
（2）连接酶失活 对策：更换连接酶
（3）PCR产物中含有抑制连接的成分，导致连接失败
对策：将PCR产物和连接反应对照混合，观察是否存在抑制效应。如怀疑有抑制成分存在，应重新纯化PCR产物。
（4）PCR产物没有3’A突出端，不能连接
对策：使用能产生3’A突出端的DNA聚合酶或平端PCR产物先通过聚合酶及dATP进行加尾反应产生3’A突出端，再与T载体连接。
（5）载体T突出端丢失，引起载体平端连接
对策：避免核酸外切酶的引入，降解T突出端。只使用无外源核酸酶的T4连接酶。
（6）插入片段与载体比例不理想 对策：优化比例 |