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4.免疫胶体金标记技术(immunologic colloidal gold signature，ICS) 胶体金是分散相粒子的金溶液，经凝聚法制成的金溶胶颗粒表面带有较多电荷，能吸附抗体形成金标记的抗体。用这种金标记抗体与组织或细胞标本中的抗原反应，借助显微镜观察颜色分布即可定位、定性测定组织或细胞中的抗原。该法最早用于免疫胶体金标记电镜技术，利用胶体金颗粒高电子密度，经衬染后对超微切片中的抗原作定量或定位研究。继后又应用于光镜并根据金催化还原银离子的原理，结合摄影技术以银增强金标抗体的可见性，建立了免疫金银法(IGSS)。此外，若将荧光素吸附于胶体金，在荧光显微镜下作定向性分布及定位观察荧光染色标本，可增强荧光效果。胶体金标记技术发展较快，如胶体金斑点渗滤试验和胶体金斑点免疫层析试验，尤其是后者检测敏感度高，操作简单，时间短，1～2分钟即可出现结果，已应用于HCG和HBV和两对半的检测。方法简述如下(图18.6)，试验用的均为干试剂，多个试剂被组合在一狭长的试剂条上，条上端(A)和下端(B)分别为吸水性材料，胶体金标记的特异性抗体干片粘贴在B的近D处，紧接着为硝酸纤维膜，其上有两个反应区域，测试区(T)包被有与待检抗原相应的特异性抗体，对照区(C)包被有对应的抗IgG抗体(二抗)。测试时将试纸下端浸入液体标本中，通过吸水材料虹吸作用吸引标本液向上移动，经过D处时如标本中有与金标抗体相应的抗原，两者即结合，胶体金颗粒发生聚集变为红色。反之则不发生变化。过剩胶体金标记的抗体继续向前，与对照区的二抗结合，出现红色质控条带。 图18.6 免疫胶体金层析法原理示意图 第二节 检测免疫细胞的方法 是用体外或体内试验对机体的各种参与免疫应答的细胞进行鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断，预后及疗效观察等也有一定意义。 一、免疫细胞的分离 体外测定免疫细胞首先要从外周血或淋巴组织中分离所需的细胞。其主要方法是根据细胞的表面标记、理化性状及功能等方面的差别进行设计。常用的方法有密度梯度离心法辅以花环沉降或亲合板粘附法(panning)等。目前最先进的方法是用荧光激活细胞分离仪(fluorescenceactivited cell sortor，FACS)可自动、快速和大量地分出各类纯度高、活性强的细胞。 (一)外周血单个核细胞的分离 图18.7 淋巴细胞分离(Fieoll密度梯度法) 主要方法为聚蔗糖泛影葡胺分层液(ficoll hypaque)密度梯度离心法。分离人外周血单个核细胞时，通常将分层液的比重配成1.077，肝素抗凝血置分层液上，于水平离心机2000r/min离心20分钟，血液中各种细胞因比重不同而被分开(见图18.7)。此外，分层剂还可选用Percoll、Metrizamid及牛血清白蛋白(BSA)等。分离不同动物血中单个核细胞时，对分离液比重的要求各不相同，如小鼠为1.088，大鼠为1.084，马为1.090等。 (二)T、B及其他免疫细胞的纯化 经密度梯度离心法获得的单个核细胞是不均一的细胞群，还可根据各种细胞的生物学特性、表面标记等进一步纯化。例如单核细胞等具有粘附和吞噬作用，可用玻璃或塑料容器的粘壁法和吞噬羰基铁颗粒的磁铁吸引法除去或获得。绵羊红细胞能与人T细胞形成E花环，藉此可通过花环沉降法分离T与B淋巴细胞。此外，利用B细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，也可将T和B细胞分开。 |