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图18.8ELISPOT原理示意图 3.ELISA-空斑试验(ELISA-plaque assay) 又称酶联免疫斑点试验(enzyme linked immunospot，ELISPOT)。该法与ELISA不同之处是，加入的待检标本是细胞，而非可溶性物质；所使用的底物可形成不溶性终产物。原理和步骤参见图18.8。ELISPOT不仅可应用于B细胞分泌抗体功能的测定，也能检测分泌细胞因子的T细胞和巨噬细胞。现已有应用该技术于计数类风湿因子分泌细胞的报道，但尚未在临床推广。 (三)其他淋巴细胞功能的检测 1.NK细胞活性测定 包括两个方面：一是NK细胞的自然杀伤活性，另一是ADCC活性。 ①NK细胞的自然杀伤功能的检测。NK细胞的功能无需抗原或有丝分裂原的刺激，亦不依赖抗体或补体。其测定方法主要是体外同位素释放法。试验时将分离的淋巴细胞与51Cr标记的敏感靶细胞(K562)共育于37℃4小时，离心取上清用γ计数器测放射性强度，其与NK细胞活性成正比。②ADCC试验。有以下两种方法。第一空斑形成法：是将鸡红细胞在经多聚L-赖氨酸处理过的玻片上形成单层细胞，加入一定量的抗鸡红细胞抗体及人淋巴细胞，作用一定时间后，由于杀伤性细胞的ADCC效应，使其周围的鸡红细胞被溶解，于低倍镜下可见空斑。计数空斑可算出NK细胞的百分率。第二51Cr释放试验：与空斑形成法的主要区别是观察指标不同。所用的靶细胞除需用相应的抗体处理外，还要用51Cr标记。当靶细胞破损后，标记的51Cr放出胞外，不能再被其他细胞吸收。用γ计数器测量上清中的放射性强度可反映靶细胞破坏程度，从而得知NK细胞的相对水平。 2.LAK细胞活性测定 LAK细胞直接杀伤多种肿瘤细胞的作用依赖于IL-2的存在。若将受检细胞(效应细胞)与瘤细胞(靶细胞)按一定的效/靶比例混合，再加入一定浓度的IL-2，37℃孵育一定时间后即可影响瘤细胞的代谢，进而杀伤瘤细胞。目前多采用同位素标记法，根据加入同位素先后次序的不同，可分为前标记法(试验前先用51Cr标记靶细胞)和后标记法(即在效靶反应后掺入3H-TdR)。前者通过测定上清液的放射性强度判断LAK细胞活性；后者则在培养结束后收集细胞，测其放射性强度，此与LAK活性成反比。 (四)吞噬细胞功能检测 1.中性粒细胞吞噬功能的测定 较早应用的方法为N试验，即中性粒细胞在杀菌过程中能量消耗剧增、耗氧量增加、糖代谢增强，致使糖代谢的中间产物6-磷酸葡萄糖增多，并在己糖途径中氧化脱氢，脱下的氢可被胞浆中的硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium，N)所接受，使原来淡黄色的N还原成蓝黑色的沉淀物，沉积在胞浆内。试验时取抗凝血与等体积N混合，37℃温育一定时间后推片，经瑞氏染色后镜下计数百分率，正常人为10%左右，全身性细菌感染患者可见升高。此外，根据细胞的吞噬作用，将抗凝血与等量5×107/ml的菌液混合，经37℃温育一定时间后推片、染色，于油镜下观察细胞吞噬细菌的情况并计算吞噬率和吞噬指数。 吞噬率＝[吞噬细菌的细胞数/中性粒细胞总数(200个)]×100％ 吞噬指数＝(200个粒细菌吞菌总数/200个中性粒细胞)×100％ 2.大吞噬细胞的检测 ①巨噬细胞吞噬功能的检测：巨噬细胞具有吞噬大颗粒异物的特性，因此常选用鸡红细胞、白色念珠菌、酵母菌等作为吞噬颗粒。将通过斑蟊发泡法获得的细胞与鸡红细胞悬液于体外37℃温育一定时间，离心后取细胞涂片染色，镜检计算吞噬百分率和吞噬指数即可估计病人巨噬细胞的吞噬功能。②巨噬细胞其他功能的测定：巨噬细胞具有多种胞内和胞外酶，也可分泌一些可溶性因子，这些物质在一定程度上可反映该细胞的功能状态。胞内酶通过细胞化学染色法检测，例如最常用的酸性磷酸酶及特异性酯酶的测定。溶菌酶是巨噬细胞的一种胞外酶，其可在体外溶解细菌，若将血清与一定量细菌悬液混匀于比色杯内，经光电比色后记录每分钟光密度变化百分率，与标准曲线相比即可得出标本中血清溶菌酶的含量。 |