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第三节 细胞因子的检测 随着免疫学理论研究的深入，发现的细胞因子日益增多，并在免疫应答的调节和效应中起着重要作用，其在体内水平的高低直接反映机体的免疫状况。因而细胞因子的检测受到重视。检测的方法主要分三类：①细胞生物学活性检测法。②免疫学标记技术，常用ELISA。③分子生物学方法，常用逆转录PCR检测细胞因子的mRNA转录的情况。免疫标记法和分子生物学方法参见本章相关节内容，现以生物活性法为例选择性地介绍几种细胞因子的检测。 一、人类干扰素的检测 人类干扰素(humaninterferon，HuIFN)有α、β和γ三种，其中HuIFN-γ由T细胞产生，三种HuIFN都有抗病毒作用，因此可利用病毒的各种生物学特性建立相应的检测方法，如血凝素生成抑制试验，是以人肺癌细胞株A549作为小鼠脑脊髓心肌炎病毒的敏感细胞，将此病毒接种于A549的单层细胞培养中，可产生使人“O”型红细胞凝集的血凝素。若在此培养中加入可能含有IFN的血清标本，由于IFN能抑制病毒在细胞中的生长，而使血凝素产生降低，借助“O”型红细胞的凝集反应判断IFN的活性。本方法既可定性又可定量。 二、白细胞介素-1(IL-1)的检测 取肝素抗凝血经分层液(比重1.077)离心分离单个核细胞，配成一定的浓度加入塑料培养板孔中温育1~3小时，洗去未粘附细胞，然后每孔加入含一定浓度LPS的细胞培养液，继续温育一定时间，收集上清液检测IL-1活性。 IL-1活性最常用的检测法是小鼠胸腺细胞增殖反应。该法原理：IL-1可辅助ConA或PHA等刺激小鼠胸腺细胞的增殖，增殖细胞的DNA合成增加。在细胞培养结束前6小时加入3H-TdR，待培养结束时收集细胞，检测放射性强度，即可判断IL-1活性。由于IL-1能促进小鼠T细胞传代株LBRM-33和EL-4分泌IL-2，当含IL-1待检样品加入上述细胞培养液，则培养上清IL-2增加，再用IL-2依赖细胞株测定分泌IL-2的多少，可间接推测样品中IL-1含量。其他IL的生物学检测方法大致相同，增殖反应细胞常采用IL的依赖株。 三、肿瘤坏死因子(TNF)的检测 TNF的主要生物学功能是对某些肿瘤细胞具有细胞毒作用。常用于TNF检测的敏感细胞系为L929细胞，基本方法如下：收集处于对数生长期的L929细胞，经洗涤、计数后调节到适宜浓度，加入至96细胞培养板中，37℃、5%CO2培养16~24小时，换液后在各孔内加入不同稀释浓度的待检样本，再加入适量的放线菌素D和培养液，继续培养16小时左右，加入100μl MTT，培养6小时后，轻轻吸去上清，加入酸化异丙醇，再在570nm波长下测定光密度，其光密度值与TNF细胞毒功能成反比，据此推测样本中TNF含量。TNF的检测在某些炎症、自身免疫性疾病、移植排斥反应、重症肝炎等疾病的诊断、监测中有一定意义。 第四节 分子生物学技术在免疫检测中的应用 |