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     8 TaqMan探针实时PCR

     TaqMan探针实时PCR是美国Applied Biosystem 公司开发的方法，该方法不仅可以进行基因的定量检测之外，还可以进行各种SNP的鉴定。进行SNP鉴定时，需要设计1对引物和1对探针，其中探针3'和5'端分别标记上淬灭荧光基团和不同的报告荧光基团。报告基团的荧光基团通常为FAM和VIC。将引物和探针置于一个PCR反应体系，在退火阶段，每条探针只能和对应SNP位点结合，然后Taq酶发挥5'外切核酸酶活性切断探针，释放出相应的报告荧光基团。最后根据产生的荧光的不同来鉴定SNP位点。TaqMan探针的新发展－TaqManMGB探针技术将MGB（minor groove binder）引入TaqMan探针中，显著的提高了信噪比、淬灭效果，此外还提高探针Tm，可以设计更短的探针，增强了TaqMan探针的SNP的鉴定能力。目前，TaqMan探针实时PCR已经成功用于HPA1—3、5、15的基因分型，检测效果优于传统的PCRSSP法［13—15］。TaqMan探针实时PCR实现了闭管检测，不需要PCR后处理，避免了交叉污染，检测SNP准确性高，省时。但是价格较昂贵，以及需要实时定量荧光PCR仪。

     9 基因芯片

     基因芯片是顺应人类基因组计划而出现的一项基因分析技术，该技术工作原理与经典的核酸分子杂交方法是类似的，均是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶序列杂交，随后通过信号检测进行定性或定量分析。Bugert等［16］使用第四代基因芯片技术对HPA1—3、5、15进行了基因分型。他们针对每个HPA等位基因系统设计了3条探针，将15条探针，点样在玻片上，制成HPA的检测芯片。然后将荧光Cy3标记的HPA各系统的多重PCR产物与芯片上的特异性探针杂交，使用芯片激光扫描仪判读结果。研究表明，基因芯片的检测结果和TaqMan探针技术是完全一致的。这个基因芯片技术可以同时检测4个HPA系统的等位基因，而TaqMan探针仅能同时检测1个HPA系统的等位基因。Beiboer等［17］建立了能同时检测HPA1—5、15系统等位基因的基因芯片方法，他们针对HPA3等位基因设计了28个特异性杂交探针，其它的HPA系统设计了20个探针。研究表明，该法与血清学方法（HPA1—5）以及TaqMan探针法(HPA15)的检测结果完全一致。Denomme等［18］使用基于多重PCR寡核苷酸延伸分析原理的基因芯片技术，成功检测了HPA1和11种红细胞抗原基因。他们设计了12个延伸引物，该引物的5'端序列和芯片上的探针互补，3'端序列和各SNP位点相邻序列互补。进行12对引物的多重PCR后，各延伸引物掺入了相应的荧光标记的末端终止碱基而被延伸。然后与芯片上的探针杂交，最后依据芯片上的各杂交点的位置和荧光颜色判读结果。该法的结果是和RFLP、血清学方法完全一致。基因芯片在很小的支持物（如硅片、玻片等）表面集成了大量的探针，具有极高的通量，能够同时进行大规模、多基因的分析，是一个很有发展前景的HPA基因分型方法。