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2 结果
2．1 荧光定景PCR法的特异性 结核分枝杆菌H37Ra出现特异扩增，凝胶电泳出现107 bp条带。对该PCR产物进行测序，序列分析显示为结核分枝杆菌核酸序列，其他非结核分枝杆菌扩增结果均为阴性。
2．2 荧光定量PCR法的灵敏度与线性 以10倍梯度稀释配制原始拷贝数102～107Copies/ml的标准品系列，取4ul 进行分子信标荧光定量PCR，绘制标准曲线，其回归方程为Ct=-3.61344 logC0+45.78456，线性范围为4 X 102～107Copies/ml，r=0.99503，Ct值与DNA模板含量呈线性关系。经多次重复试验，最低可检测4 Copies/反应。如图1。
2．3 肺结核的诊断 采集168份疑似结核病人痰标本，集菌培养法和涂片染色法阳性检出率分别为35.12%(59/168)、12.5%(21/168)，荧光定量PCR法阳性检出率64.29%(108/168)，显著高于抗酸染色法和培养法，漏检率低。对抗酸染色法和培养法阳性的样本，荧光定量PCR法的灵敏度分别为100%和95.4%。对于非结核病人来源的痰标本，荧光定量PCR方法检测结果为阴性，符合率为100%。
2．4 随访检测 随访周期3个月，对5例活动性肺结核进行了动态检测。荧光定量PCR检测结果显示，随着临床治疗方案的进行，病人晨痰中结核分枝杆菌的数量呈持续下降的趋势(即Ct值增加)。图2为随访期间连续4次测定病人标本的结果，Ct值分别为26.60、27.58、28.25、29.14，呈连续增加。为保证检测结果的准确性，每份晨痰都进行平行测定。
随访期间，3例病人转阴，2例仍为阳性。病例1为男性，23岁，发病时间约2个月，病程较短，病情较轻，治疗前X线检查未见异常，痰涂片检查：涂阳1+，服药后在1个月内迅速转阴，结核分枝杆菌从105copies/ml 减少剑不能检出。病例2、3、4、5治疗前X线检查均有不同程度的异常，病程较长，患病时问在半年以上。如病例2为男性，41岁，X线检查右上肺可见斑片状、条索状模糊影，密度不均，边缘不清．其中间见一空洞，无栗粒。痰涂片检查结果为涂阳3+，诊断为III 型涂阳肺结核患者。经过3个月的治疗，4例病人咳嗽、咳痰等临床症状均有减轻。病例2和3涂片与荧光定量PCR检测结果均转阴性，病例4、5仍为阳性。图3为随访各病例结核分枝杆菌Ct值随时间的变化曲线。
3 讨论
荧光定量PCR是近年发展迅速的基因诊断技术。与传统检测方法比较，荧光定量PCR的阳性检出率有显著提高，本研究中荧光定量PCR与传统的培养法和涂片法的阳性检出率分别是64.29%、35.12%、12.5%，与文献报道一致[1-7]。而且荧光定量PCR法极大地缩短了检测的时间，有助于对病人确诊并及时采取治疗手段。目前临床所用实验室检测方法十分落后，已成为阻碍我国结核病防治工作顺利展开的重要原因，在基层建立和推广特异性强、灵敏度高的检测方法非常必要。
在对5名确诊结核病人的随访中发现，经过3个月的治疗，3名病人痰液中不再有结核分枝杆菌检出。另2名病人由于感染时间较长，并有较大程度的器质性改变，经过治疗虽未很快转阴，但排出的结核分枝杆菌数量也有显著减少。在随访监测期问，荧光定量PCR检测结核分枝杆菌的Ct值随着治疗的持续进行呈不断增加的趋势(即细菌数量减少)，且病人的临床症状均有所缓解。为确保随访的持续有效，本次符合的病例较少，对结核病治疗效果评价的规律还有待更多研究。但是，本次研究采用荧光定量PCR方法监测结核分枝杆菌变化情况，观察抗结核药物的治疗进展，并将治疗信息反馈给临床督导医生的方式，为临床医生及时掌握病人的病情和开展后续督导治疗提供了动态的数据，在实践中起到了积极的作用，效果明显，有重要的临床意义。
参考文献:略
作者信息：深圳市龙岗区疾病预防控制中心 王式春 刘渠 徐亚军
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