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【摘要】目的 建立荧光定量PCR检测结核分枝杆菌方法，评估其在肺结核的临床诊断和疗效评估中的应用价值。方法 针对结核分枝杆菌保守序列IS6110基因设计引物和探针，建立荧光定量PCR方法。分别以荧光定量PCR、集菌培养和染色镜检法检测疑似肺结核和确诊病人随访的痰标本，比较各方法在结核病诊断以及治疗效果评估中的作用。结果 荧光定量PCR的检测灵敏度为4 Copies/反应，远高于抗酸染色法和集菌培养法。荧光定量PCR法与集菌培养法和抗酸染色法对临床样本的检出率分别为64.29%、35.12%和12.5%。病人治疗效果的随访检测结果显示．结核分枝杆菌的数量呈持续减少的趋势。结论 荧光定量PCR方法具有快速、敏感和特异性高的特点，可以快速、及时获取病人服药后的治疗效果，为医生的后续督导治疗提供依据，具有重要的临床意义。
【关键词】分枝杆菌 荧光定量PCR 基因诊断 疗效观察
目前结核病仍是全球性的重大公共卫生问题之一。全球现有肺结核病人2000多万，其中95%在发展中国家，我国是22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核患者居世界第二位，每年因结核病死亡的人数达剑15万人，给国家和社会带来沉重负担，严重影响我国经济和社会的发展[1-3]。
结核分枝杆菌的实验室检测是结核病诊断和治疗转归确认的重要依据。提高实验室检测能力，促进早诊断、早治疗是有效控制结核病蔓延的必要措施。目前临床以集菌培养和染色镜检法为主要的实验室检测手段。大量研究表明，传统方法的检出率低、培养周期长，难以满足临床需要。荧光定量PCR是近年发展起来的一种重要的基因诊断技术，具有灵敏度高、特异性好、可定量、污染少、易于标准化等优点，得到了广泛的应用[4-5]。本研究建立了荧光定量PCR检测临床结核分枝杆菌的方法，并对荧光定量PCR在临床肺结核诊断和疗效评估中的应用进行了评价，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1．1 标本
1．1．1 疑似病人 采集2009～2010年5月到深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者的痰液标本168份，其中男性115份，女性53份，年龄15～60岁。
1．1．2 确诊患者 选择临床确诊肺结核病人，有低热、乏力、食欲不振、咳嗽和少量咯血等典型肺结核表现，X线健康检查肺部有结核病灶，实验室检测结果为阳性。为确保样本采集的连贯性，在争取病人同意随访的同时，选择暂时在家休养的就近病人。跟踪随访采集深圳市龙岗区慢性病医院诊断与治疗患者漱口后痰液，选取3例活动性肺结核患者，采集病人服药前1天的晨痰，随访中1～7日内每天采集1次，后续间隔2～5天采集1次。
1．2 仪器 Bact/Alert 3D全自动细菌快速培养和药敏检测系统、Heraeus低温冷冻离心机Megafuge 1．0R、Biospec-mini DNA/RNA/Protein analyzer(岛津)、7500荧光定量PCR扩增仪(Applied Biosystems)、凝胶成像系统(英国UVI tec)。
1．3 抗酸染色法与集菌培养法 操作参考《结核病诊断细菌学检验规程》[6]进行。
1．4 痰液DNA的提取 取0.5ml 痰标本加入2倍样本体积4%的NaOH，液化10min后15000r/min离心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml 灭菌水，充分振荡混匀，15 000r/min离心2min，去上清液，重复洗涤3次；沉淀中加入50 ul DNA提取液(1%NP-40 +2%Triton X-100)[4]，充分振荡混匀，100℃水浴10min；待冷却至室温，15 000r/min离心5min，取上清液备用。
1．5 荧光定量PCR方法[7-10]
1．5．1 引物与探针设计 针对IS6110基因设计引物与探针，上游引物：5’-GTC GCC CGT CTA CTT AAT G-3’，下游引物：5’-GCG GAT TCT TCG GTC GTG-3’，产物长度为107bp。探针：5’FAM-CCG ACG GTG CGT AAG TGG GTG CGT CGG-DABCYL3’，由上海基康生物技术有限公司合成。
1．5．2 反应条件 反应体系(40 ul )：4.0 ul 10 X buffer，7.0mmol/L Mg2+，200 umol/L dNTP，0.2 u mol／L上下游引物，0.2 p mol/L探针，4 ul DNA模扳，2.5U Taq DNA聚合酶。扩增条件：94℃3min，94℃20s，52℃20s，72℃20s，40次循环。试验设定阳性对照、弱阳性对照与空白对照(no template control，NTC)。按照荧光定量PCR分析软件设定基线(baseline)与阈值(threshold)，以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。
1．5．3 标准品制备 以结核分枝杆菌H37Ra为参考菌株，PCR扩增IS6110基因并克隆刮质粒载体。提取纯化重组DNA，10倍梯度稀释至107Copies/ml 作为强阳性标准品，103Copies/ml 作为弱阳性标准品。
1．5．4 特异性 以结核分枝杆菌H37Ra为阳性标本，提取牛型分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾分枝杆菌、草分枝杆菌、龟分枝杆菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏菌为模板检测引物与探针的特异性。
1．5．5 灵敏度与标准曲线绘制 抽提标准品DNA，10倍系列准确定量稀释102~107Copies/ml 的DNA模板，分别取4ul进行荧光定量PCR扩增。
1．5．6 结果判定 荧光定量PCR扩增曲线规则，呈对数增长，Ct值≤36即可判定为阳性；如扩增曲线不规则或Ct值>40，报告为阴性；如Ct值在36～40之间，且扩增曲线呈对数增长，样本重复测定，如Ct值仍在36～40之间报告为阴性。
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