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3 操作中的因素 3.1 加样 孵育前加样时间过长，酶试剂加出孔外，使用滴瓶滴加试剂时，滴加的角度不同和挤压的力度不同，致使滴加的试剂量不准，都可导致试验结果不准确。控制方法：①实验样本过多时，可分批次操作，以减少实验时间延长造成的误差；②加酶试剂后，用吸水纸吸干孔外试剂；③作定量试验时，使用加样器加注试剂，并经常校正其准确性，此外，要做到一份样本一个移液头，防止交叉污染。 3.2 温育 温育是ELISA测定最为关键、最容易出现问题的步骤。最为常见的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。目前国内售ELISA 试剂盒温育时间为37℃，30 min~1 h，进口ELISA试剂盒则通常为37℃，1～2 h 能有较完全的结合。 3.2.1 温育时间、温度的选择一般根据试剂盒的说明书选择温育的时间、温度。加完样本和（或）试剂后将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃需要一定时间，如果是将微孔板一放入温箱即开始计时，这样就容易造成实际测定中温育时间不够，易致弱阳性标本测不出来。控制方法：①如有两种温度，尽量使用较低的温育温度、较长反应时间的条件；②用1个小温度计放置在板孔反应液中测量观察。 3.3 洗板 ELISA测定的洗板一般有两种方式，即手工和洗板机洗板。采用手工洗板，孔与孔之间液体易交叉，采用半自动洗板机时，洗液量不足导致洗板不彻底，洗板针堵塞导致抽吸不完全，洗板不畅导致清洗效果差。控制方法：①手工洗板时，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离；②洗板机洗板时应经常检查冲洗头是否通畅，若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出；③为了洗涤效果好，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，在机器洗涤后再进行人工洗板1～2次，或适当增加洗板的次数，有资料报道洗板7 次能达到理想的洗涤效果[5]。 3.4 显色 市售ELISA 试剂盒中，如以四甲基联苯胺(TMB)为底物，则提供的底物为A 和B 两瓶应用液；如以邻苯二胺(OPD)为底物，则试剂盒提供邻苯二胺片剂或粉剂。显色反应条件为37℃或室温反应15～30 min。以邻苯二胺(OPD)为底物的试剂，要临用前30 min配制且必须避光。以四甲基联苯胺(TMB)为底物的试剂则不需避光，但 A、B 液应尽量避免接触金属器械。 3.5 结果判定 读取结果要在15～30 min内完成，定性测定用肉眼判读试验结果时，反应板应水平距离白色背景10~15 cm；定量测定时用酶标仪读取结果，酶标仪不应置于阳光或强光照射下，需先预热15～30 min再进行测试。 综上所述，尽管ELISA法操作简单，但可能影响测定结果的因素也较多。故在实际操作的过程中，要加强质量管理，认真避免或减少影响因素，力求结果准确，为疾病的诊断和科研提供可靠的依据。 |