|
1.2.3 PBMCs中HHV6和HHV7 DNA的检测采用巢式PCR方法。PCR引物设计及巢式PCR反应条件均参照文献 ［1］，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物序列见表1。同时设立阳性对照和阴性对照，HHV6阳性对照为HHV6标
表1 巢式PCR引物序列（略）
取PCR产物10 μL，20 g/L琼脂糖凝胶（含0.5 mg/L EtBr）中电泳，80 V、1 h，紫外线透射仪下观察结果。HHV6外侧PCR扩增产物为287 bp，内侧PCR扩增产物为163 bp；HHV7外侧PCR扩增产物为186 bp，内侧PCR扩增产物为124 bp。
1.2.4 限制性酶切分析 取HHV6、HHV7内侧PCR阳性扩增产物分别用HindⅢ和 EcoRⅠ进行限制性内切酶分析。酶切产物于120 g/L聚丙烯酰胺凝胶中电泳，80V、90 min，凝胶用EtBr（0.5 mg/L）染色20 min。紫外线透射仪下观察结果。
1.3 统计学分析
采用SPSS四格表卡方检验。
2 结 果
2.1 HHV6 DNA检测RA病人PBMCs中有34例HHV6 DNA阳性，阳性率为54.84%；对照组PBMCs中有73例HHV6 DNA阳性，阳性率为52.90%（见图1）。两组 HHV6 DNA阳性检出率差异无显著意义（χ2=0.002，P>0.05）。34例PBMCs HHV6阳性RA病人血浆中23例检测出HHV6 DNA ，阳性率为37.10%，而对照组血浆中未发现HHV6 DNA阳性者。
2.2 HHV7 DNA检测
RA病人PBMCs中有38例HHV7 DNA阳性，阳性率为61.29%；对照组PBMCs中有80例HHV6 DNA阳性，阳性率为57.97%（见图1）。两组HHV7 DNA阳性检出率差异无显著意义
图1 部分标本PBMCs中HHV6、HHV7 DNA 内侧 PCR检测结果
2.3 PCR产物的限制性酶切分析
HHV6内侧PCR阳性扩增产物（163 bp），经限制性核酸内切酶Hind Ⅲ酶切后可观察到两种情况，HHV6A酶切产物为 66 bp和97 bp 两条带，而HHV6B不被消化仍为163 bp的内侧PCR扩增条带。RA病人组34例HHV6阳性者中，有30例病人为HHV6B型（88.24%），有4例为HHV6A型（11.76%）；73例HHV6阳性正常对照者中HHV6A型占17.81%（13/73），HHV6B型占82.19%（60/73）。RA病人组与正常对照组HHV7内侧PCR阳性扩增产物（124 bp）经限制性内切酶EcoRⅠ消化后均出现79 bp和54 bp两条带，证明为特异性扩增条带。
|