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碱性苦味酸速率法测定的原理是肌酐同碱性苦味酸反应形成一种红色复合物，通常在510 nm处根据测定一定时间（20～80 s）内血清和标准液吸光度的增加量计算肌酐的含量。而胆红素在510 nm处也有较强光吸收，并且在氢氧化钠的作用下，逐渐转化为620nm处有强光吸收的胆绿素，而胆绿素在520 nm处只有很弱的光吸收，这样就掩盖了肌酐本身的显色反应的表现，从而使测定结果偏低，甚至出现负值［1］。 经过查阅有关文献和多次实验，发现胆红素在37 ℃和强碱环境下被氧化成胆绿素［2］，导致510 nm处吸光度减少的时间为两者混合后50 s以内，50 s以后510 nm吸光度下降缓慢或基本不变。我们根据这一发现并结合BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪的特点，将原来的双液体试剂反应步骤进行了改进，把原来的一步法改为两步法（以下原方法和改良方法简称为一步法和两步法）。这种改进后的方法可以有效地消除胆红素对肌酐测定的负影响。 1 材料与方法 1.1 试剂 碱性苦味酸试剂（试剂R1：300 mmol／L氢氧化钠；试剂R2：20 mmol／L苦味酸）由上海丰汇医学科技公司提供。肌酐标准液、高、中、低定值质控血清：美国进口。仪器：BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪。 1.2 方法 （1）20 μl血清（TBIL：408 μmol/L）与200 μl试剂R1（300 mmol／L氢氧化钠）混合后，连续检测该混合物分别在520 nm和620 nm处吸光度的变化。结果发现48 s以后520 nm吸光度下降缓慢或基本不变，而620 nm处吸光度在32 s后上升缓慢或基本不变。胆红素被氧化成胆绿素的反应主要发生在标本和RI液混合后50 s以内。（2）根据上述发现并结合BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪的特点，调整后的反应参数。20 μl血清与200 μl试剂R1（300 mmol／L氢氧化钠）反应16 s后加入50 μl试剂R2（20 mmol／L苦味酸），在试剂R2加入后16 s读取起始吸光度（A1），再过48s读取终末吸光度（A2），计算时用A2-A1=ΔA，肌酐的含量为:肌酐（μmol/L）=样品ΔA/标准ΔA×标准浓度（μmol/L）。主波长520 nm，副波长560 nm，反应温度37 ℃。 2 结果 2.1 两种方法的比较 选取胆红素和肌酐正常参考值范围的低值定值质控血清（TBIL 10.7 μmol/L、CREA 46 μmol/L），分别用一步法和两步法在BECKMAN-CX5型全自动生化分析仪各连续测定测定肌酐浓度20次，一步法测定结果:x=45.8 μmol/L，s=2.231,CV=4.9%；两步法测定结果x=47.0 μmol/L,s=2.066,CV=4.4%。经配对t检验，t=1.9880.05,两者无明显差异，并且二者测定结果都接近靶值。 2.2 方法的精确性 本方法低（TBIL 13 μmol/L,CREA 119 μmol/L）、中（TBIL 70 μmol/L,CREA 348 μmol/L）、高（TBIL 150 μmol/L,CREA 645 μmol/L）三种质控血清批内变异系数（CV）依次为4.8%（n=20，x=119.4 μmol/L，s=3.51）、2.94%（n=20，x=349.2μmol/L，s=6.92）、0.84%（n=20，x=643.8 μmol/L，s=5.41），批间CV依次为3.79%（n=20，x=120.8μmol/L，s=4.59）、2.06%（n=20，x=350.1μmol/L，s=7.2）、1.52%（n=20，x=640.1μmol/L，s=9.72），精密度良好。 |