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1.2.3 总RNA提取
分别挑取伤寒沙门菌野生株和ssrB缺陷株单菌落于1 ml等渗LB液体培养基中培养(37 ℃，250 r/min)过夜后，以1∶100分别转接于20 ml等渗LB液体培养基中培养(37 ℃，250 r/min，3 h)至对数生长期后，向LB培养液中加入4 mmol/L H2O2进行氧应激15 min，置于冰上冷却10 min，离心(4 000 r/min，4 ℃，10 min)，弃上清，收集菌体。用TE缓冲液洗菌体1次，离心(4 000 r/min，4 ℃，5 min)，收集菌体。用RNA提取试剂盒提取细菌总RNA后，用无RNA酶的DNase I消化(37 ℃ 15 min，80 ℃ 15 min)残量DNA。用核酸检测仪测定RNA浓度(如后续进行芯片分析，要求RNA总量大于50 μg)，同时取少量RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量(要求RNA条带清晰，无残余DNA)。
1.2.4 RNA逆转录与cDNA荧光标记
RNA逆转录与cDNA荧光标记体系：RNA 20 μg， N9引物 3 μg，GDP引物[9-10] 3 μg，加无RNA酶的ddH2O至总体积14.5 μl，70 ℃预变性10 min后，再按说明书加入逆转录试剂盒中的5×缓冲液，RNA酶抑制剂，dNTPs， MDTT，逆转录酶，最后加入荧光素标记的Cy3或Cy5dCTP，总体积30 μl，逆转录的反应条件为25 ℃10 min，50 ℃4 h，85 ℃10 min。为了尽可能减小标记差异，对野生株和缺陷株cDNA的标记采用Cy3和Cy5配对互标。
1.2.5 基因芯片杂交、扫描及结果分析
基因芯片在正式杂交前4～6 h，在点样区加预杂交液进行活化。逆转录得到的cDNA产物经试剂盒纯化后，加入杂交液，混匀，95 ℃，避光，变性10 min。将准备好的杂交液加在基因芯片已活化的点样区，42 ℃，避光，杂交16 h。用芯片扫描仪扫描杂交后的芯片，得到的图像与数据用GenePix Pro6.0软件进行处理和分析。平行操作的两张互标的芯片可提供每个基因的4个数据，通过进一步的数据分析，最后定义表达差异1倍以上的基因作为在野生株与缺陷株中表达有差异的基因。基因芯片实验重复3次。
1.2.6 实时定量PCR(qRTPCR)
采用Takara公司的实时定量PCR试剂盒进行实验。反应体系：cDNA模板1 μl，待测基因的上下游引物各1 μl，试剂盒内含有PCR缓冲液、dNTP、Ex Taq DNA聚合酶和SYBR Green的混合物 17 μl。实验生物学重复3次，每次设平行对照组。得到的qRTPCR结果用Student′s t检验进行统计分析。
1.2.7 HeLa细胞的培养
使用含10%小牛血清的RIPM1640培养基，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养HeLa细胞，每2天传代1次。
1.2.8 伤寒沙门菌侵袭HeLa细胞
实验前1天，HeLa细胞以2×105/孔接种于24孔板。实验前1 h，以预热的PBS洗细胞3次，最后每孔加入新鲜的培养液1 ml。挑取伤寒沙门菌野生株和ssrB缺陷变异株单克隆分别接种于1 ml等渗LB培养液中，37 ℃振荡(250 r/min)培养过夜，实验前3 h，以1∶100的比例转接至新鲜LB培养基中至D(600 nm)值0.4(大约3×108cfu/ml)。将细菌以与细胞20∶1(MOI值)的比例加入到24孔板，37 ℃、5%CO2的培养箱中侵袭Hela细胞90 min，每孔以预热的PBS洗细胞3次后，或加入0.1% PBSDOC作用10 min破膜(T0)，收集从细胞中释放至破膜液中的细菌，涂平板，12 h后计数菌落数;或加入庆大霉素，终浓度100 μg/ml，37 ℃、5% CO2的培养箱中继续侵袭Hela细胞90 min(T90)，加入0.1%PBSDOC作用10 min破膜，收集从细胞中释放至破膜液中的细菌，涂平板，12 h后计数菌落数。以菌落数T90/T0的比值作为细菌侵袭能力的指标。实验生物学重复3次，每次设置平行对照组。结果用Student′s t检验进行统计分析。
2 结 果
2.1 伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株的制备
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