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　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌株、质粒和细胞株

　　伤寒沙门菌野生株GIFU10007，大肠埃希菌SY372λpir和自杀质粒pGMB151由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠;大肠埃希菌DH5α由本室保存;pGMET载体为Promega产品;HeLa细胞由江苏大学基础医学与医学技术学院免疫教研室馈赠。

　　1.1.2 主要试剂与材料

　　rTaq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶BamH I和Sal I、T4 DNA连接酶、RNase H、DL2000、Xgal、实时定量PCR试剂盒均为TaKaRa(大连)公司产品;IPTG为Sigma公司产品;胰蛋白胨和酵母提取物为Oxoid公司产品;RIPM1640和小牛血清为Sigma公司产品;TA克隆试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品;质粒提取试剂盒为Axygen公司产品;RNA提取试剂盒和cDNA纯化试剂盒为Qiagen公司产品;逆转录试剂盒为Invitrogen公司产品;荧光染料为Amersham Pharmacia Biotech AB公司产品;沙门菌基因组DNA芯片由本室制备保存。

　　1.1.3 主要仪器

　　PCR仪(Eppendorf);凝胶成像分析系统(Syngene);高速冷冻离心机(Eppendorf)， 电转化仪(BioRad);核酸检测仪 (NanoDrop);基因芯片扫描分析系统4100B (Axon);荧光定量PCR仪(Corbett);CO2细胞培养箱(Binder)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 引物设计

　　根据本室测定的伤寒沙门菌野生株GIFU10007基因组序列(未公布)设计引物，采用的软件为Oligo 6.0。制备缺陷株的引物设计：根据GIFU10007基因组序列显示，ssrB基因全长639 bp。根据ssrB基因及其上、下游序列设计两对特异性PCR引物P1A/P1B、P2A/P2B。在ssrB基因上游-366设计特异性PCR引物P1A，在P1A的5′端加BamH Ⅰ酶切位点，在ssrB基因204处设计特异性PCR引物P1B，在P1B 5′端加Sal Ⅰ酶切位点;在ssrB基因474处设计特异性PCR引物P2A，在P2A 5′端加Sal Ⅰ酶切位点，在ssrB基因下游821处设计特异性PCR引物P2B，在P2B的5′端加BamH Ⅰ酶切位点(图1)。以伤寒沙门菌GIFU10007为模板，扩增出570 bp同源性上游片段F1和同源性347 bp下游片段F2，通过Sal Ⅰ酶切F1和F2片段可定向连接为F1-F2片段，通过BamH Ⅰ酶切F1-F2片段可克隆至自杀质粒，同源重组后可获得中间缺失270 bp的ssrB基因缺陷株。qRTPCR引物设计：根据伤寒沙门菌GIFU10007基因组中的orgA， prgK， prgH基因序列，分别设计一段特异性引物，通过检测荧光值来观察该基因的表达情况。以上引物由上海生工生物技术服务有限公司合成，序列见表1。表1 引物序列图1 制备伤寒沙门菌ssrB基因缺陷变异株的引物设计

　　1.2.2 制备伤寒沙门菌ssrB缺陷株

　　伤寒沙门菌ssrB缺陷株制备主要参考文献[8]进行。以伤寒沙门菌野生株GIFU10007的基因组DNA为模板，用特异性引物P1A/P1B扩增ssrB基因上游同源片段F1，用P2A/P2B扩增ssrB基因下游片段F2，纯化后的F1， F2用Sal Ⅰ酶切，酶切后的F1， F2在T4 DNA连接酶的作用下定向连接成F1-F2片段。用胶回收试剂盒回收F1-F2片段与pGMET载体连接，热击法导入大肠埃希菌DH5α进行TA克隆。对阳性克隆质粒先用PCR和BamH Ⅰ酶切初步鉴定，再用DNA测序(上海生工生物技术服务有限公司完成)最后鉴定。用BamH Ⅰ酶切阳性重组质粒并用胶回收得到带有BamH Ⅰ酶切口的目的片段F1-F2，同时用BamH Ⅰ酶切自杀质粒，通过T4 DNA连接酶将F1-F2连接至自杀质粒，用热击法导入大肠埃希菌SY372λpir，对重组自杀质粒经PCR和BamH Ⅰ酶切鉴定。将带有目的片段F1-F2的阳性自杀质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株GIFU10007，在含有5%蔗糖的LB平板上培养，诱导同源重组。将连续4次传代，PCR均只扩增出缺失270 bp的小片段的菌株定义为稳定的已完全重组的伤寒沙门菌ssrB基因缺陷株。